贝类原虫病是危害贝类养殖的主要传染性疾病。目前在世界范围内危害最严重并导致重大经济损失的贝类原虫病主要是由派琴虫(Perkinsus sp)、包拉米虫(Bonamia)、折光马尔太虫(Marteilia refringens)和尼氏单孢子虫(Haplosporidium nelsoni)这四种原虫所引起。

根据世界动物卫生组织(OIE)规定，贝类派琴虫病、折光马尔太虫病和包拉米虫病是需要向OIE通报的贝类疾病。派琴虫的感染在韩国、日本和中国均有很多报道，其可引起贝壳不能闭合、生长缓慢，死亡率高达90％以上(Powell et al., 1996; Choik and Park, 1997; Hamaguchi et al., 1998; 梁玉波等, 2001)。包拉米虫是一种侵袭牡蛎血细胞的病原体，包拉米虫引起的传染病可以导致贝类死亡，该病原体引起的疾病在法国、爱尔兰、英国和美国等国家均有爆发流行的报道(Elston et al., 1986; Doonan et al., 1994; Culloty and Mulcahy, 1996; Cochennec et al., 1998)，导致了严重的经济损失。折光马尔太虫可引起贝类消瘦甚至停止生长并可导致死亡，折光马尔太虫感染在大洋洲和欧洲等国家普遍存在(Kleeman et al., 2002; Audemard et al., 2004; Carrasco et al., 2007; Lopez-Flores et al., 2008)。尼氏单孢子虫主要感染贝类消化道上皮细胞、血细胞和结蒂组织，有较高的死亡率，该病原体感染在美洲、大洋洲和亚洲等许多国家普遍存在(Haskin et al., 1966; Barber et al., 1997; Hine and Thorne#ref, 2002; Russell et al., 2004; 王中卫等, 2009)。

目前，这四种原虫病在中国主要养殖贝类中的感染情况还没有一个系统的调查结果，本研究针对这四种原虫病，从2006年到2012年间，全面系统的调查了中国不同海域的11种养殖贝类及其种苗的感染情况。旨在掌握四种原虫病在中国主要养殖贝类中分布和流行的第一手资料，及其在不同海域和不同贝类品种上的感染状况，为这四种原虫病的有效防治提供重要的科学依据。

1 结果与分析

1.1 贝类四种原虫的检出率

2006~2012年间，从辽宁、山东、浙江、福建、广东、海南和广西的海域，采集的331批共11 291份贝类样品，四种原虫的检出率见表2，部分样品的检测结果见图1。四种原虫的感染率累计为15.28% (1 725/11 291)，其中感染率最高的为派琴虫9.98% (1 127/11 291)，其次为尼氏单孢子虫3.99% (451/1 1291)，最低为折光马尔太虫1.30% (147/11 291)，未检出包拉米虫的感染。从表2中可见，尼氏单孢子虫的感染存在于牡蛎、文蛤、扇贝、菲律宾蛤仔、贻贝、血蛤、溢蛏和鲍鱼等贝类中，其中以花甲螺的感染率最高(11.78%)。派琴虫的感染存在所检测的11中贝类中，其中以菲律宾蛤仔和花甲螺感染率最高，达到26.37%和20.21%。折光马尔太虫的感染存在于牡蛎、文蛤、扇贝、菲律宾蛤仔、贻贝、血蛤和溢蛏中，其中菲律宾蛤仔和溢蛏的感染率较高，达6.67%和3.49%。包拉米虫在中国沿海11 291份贝类中均未检出。

1.2 贝类四种原虫的混合感染

在单个贝类中，存在多种原虫混合感染的现象，其中37份牡蛎、18份花甲螺、17份菲律宾蛤仔、7份扇贝和1份血蛤为尼氏单孢子虫和派琴虫这两种原虫混合感染；9份牡蛎、14份菲律宾蛤仔、2份溢蛏和2份血蛤为折光马尔太虫和派琴虫这两种原虫混合感染；1份菲律宾蛤仔和1份牡蛎为折光马尔太虫和尼氏单孢子虫这两种原虫混合感染；8份菲律宾蛤仔为单孢子、派琴虫和折光马尔太虫这三种原虫混合感染。尼氏单孢子虫和派琴虫及折光马尔太虫和派琴虫的混合感染最常见，占四种原虫感染贝类总数的4.64%和1.57% (80/1 725, 27/1 725)。两种或两种以上原虫混合感染的贝类占四种原虫感染贝类总数的6.78% (117/1 725)。

1.3不同品种牡蛎四种原虫的检出率

2006~2012年间采集的3 329份近江牡蛎、1 229份太平洋牡蛎和861份葡萄牙牡蛎的检测结果见表3。从表中可见尼氏单孢子虫在三种牡蛎中均有感染，其中以太平洋牡蛎的感染率最高，达9.44%，与其它两个品种的感染率有显著差异。派琴虫在3种牡蛎中均有感染，其中以近江牡蛎的感染率最高，达15.26%，与其它两个品种的感染率有显著差异。折光马尔太虫在葡萄牙牡蛎中的感染率最高，包拉米虫未检出。

1.4 牡蛎不同海域的检出率

2006年到2012年间从中国沿海不同海域采集的牡蛎样品检测结果见表4。从表中可见，尼氏单孢子虫感染率较高的海域为辽宁和山东省，派琴虫感染率较高的海域为浙江、广东、海南和广西，折光马尔太虫的感染仅在福建和广西的海域出现。包拉米虫未检出感染。

1.5贝类苗四种原虫的检出率

采集的贝类苗四种原虫的检出率见表5。从表中可见，派琴虫在牡蛎苗、文蛤苗、菲律宾蛤仔苗、溢蛏苗和花甲螺苗中均存在感染，尼氏单孢子虫在牡蛎苗、文蛤苗、扇贝苗、溢蛏苗和花甲螺苗中均存在感染，折光马尔太虫在牡蛎苗、文蛤苗、扇贝苗和菲律宾蛤仔苗中均存在感染，包拉米虫在中国贝类苗中未检出。

1.6 测序结果与序列分析

不同海域不同贝类，首次检测为阳性的部分样品派琴虫、折光马尔太虫和尼氏单孢子虫扩增的目的片段分别为703 bp、411 bp和573 bp，与预期大小相符。在线Blast比对分析表明，本研究的PCR产物的核酸序列，与派琴虫、折光马尔太虫和尼氏单孢子虫的基因对应片段的同源性一致，其中部分贝类样品的派琴虫与奥尔森派琴虫(GenBank登录号DQ516715)同源性最高，部分贝类样品的派琴虫与Perkinsus beihaiensis(派琴虫北海株, GenBank登录号JN054741)同源性最高。结果说明本研究所扩增的片段为派琴虫、折光马尔太虫和尼氏单孢子虫的特异性片段。

2 讨论

中国是世界贝类养殖和出口第一大国，沿海贝类养殖产量分列前三位的是牡蛎、蛤仔和扇贝，其中牡蛎养殖量最大，约占全国海水养殖总量的1/3。2010年中国贝类产量达l 108万吨，占世界总产量约65%，出口量26.5万吨，占世界出口总量的40%，出口创汇9.7亿美元。牡蛎、文蛤和菲律宾蛤仔是水产品出口创汇的主要品种，沿海的山东、辽宁、浙江、福建、广东和广西等省区是中国贝类养殖的主要基地。

贝类尼氏单孢子虫、派琴虫、折光马尔太虫和包拉米虫这四种原虫，感染贝类后不仅可引起较高的发病率和死亡率，而且还可使感染的贝类生长缓慢和消瘦，从而使养殖贝类大幅度减产而导致巨大的经济损失。摸清原虫感染和流行的情况，是其有效防控的前提基础。因此，对这四种原虫病在中国养殖贝类中的感染状况进行系统而深入的调查研究，全面了解这四种原虫病在中国贝类中的分布及流行情况，以期能找出其防治的突破点。本研究经过6年多在山东、辽宁、浙江、福建、广东、海南和广西等主要贝类养殖的海域，采集了11种贝类331批次共11 291份，并对其尼氏单孢子虫、派琴虫、折光马尔太虫和包拉米虫这四种原虫的分布和流行情况进行系统调查，这是对中国贝类原虫感染流行情况调查持续时间最长、调查范围最广、检测原虫种类最多、贝类品种和数量最多的一次，全面系统摸清了四种原虫在中国养殖贝类中感染和流行的详细情况。

调查结果显示，中国不同海域养殖贝类中普遍存在原虫的感染，四种原虫的感染率累计为15.28%(1 725/11 291)，其中感染率最高的为派琴虫9.98%(1 127/11 291)，其次为尼氏单孢子虫3.99%(451/11 291)，最低为折光马尔太虫1.30%(147/11 291)，未检出包拉米虫的感染。不同贝类品种，其四种原虫的感染情况是不同的，尼氏单孢子虫以花甲螺的感染率最高(11.78%)，派琴虫以菲律宾蛤仔和花甲螺感染率最高(26.37%和20.21%)，折光马尔太虫以菲律宾蛤仔和溢蛏的感染率较高(6.67%和3.49%)。对牡蛎感染情况的分析结果显示，不同品种的牡蛎，其四种原虫的感染情况也不相同，尼氏单孢子虫以太平洋牡蛎的感染率最高(9.44%)，派琴虫以近江牡蛎的感染率最高(15.26%)，而折光马尔太虫以葡萄牙牡蛎中的感染率最高(1.97%)。结果表明，不同品种贝类对不同原虫的易感性可能有差异，因此同一片养殖海区不应进行多种贝类混合养殖，特别是对派琴虫和尼氏单孢子虫感染率很高的花甲螺和菲律宾蛤仔，不应同其他品种贝类混合养殖，以防其原虫病的传播。同时，不同海域的牡蛎，其原虫的感染情况也是不同的，尼氏单孢子虫感染率较高的海域为辽宁和山东省，派琴虫感染率较高的海域为浙江、广东、海南和广西，折光马尔太虫的感染仅在福建和广西的海域出现，这也是在中国贝类中首次检测出折光马尔太虫的感染。

此次调查结果还显示，在单个贝类中，存在多种原虫混合感染的现象，占四种原虫感染贝类总数的6.78%(117/1 725)，其中以尼氏单孢子虫和派琴虫、折光马尔太虫和派琴虫的混合感染最常见，占四种原虫感染贝类总数的4.64%和1.57%(80/1 725, 27/1 725)。包拉米虫在中国沿海11种主要养殖贝类中均未检出，提示我们今后在从国外进行贝类引种时，应特别注意包拉米虫的检疫，以防止其从国外传入中国造成后患。

调查结果还表明，在首次对中国主要养殖贝类繁育种苗的检测中，从牡蛎、扇贝、文蛤、菲律宾蛤仔、溢蛏和花甲螺等贝类幼苗中也检测出了尼氏单孢子虫和派琴虫的感染，且感染率较高，表明种苗在贝类原虫病的流行和传播上了发挥重要作用，因此应重视对四种原虫感染的检测，防止通过种苗传染扩散原虫病。该调查报告是首次全面系统地对中国主要养殖贝类的四种原虫病进行流行病学调查的报告，调查取得了丰富的第一手资料，弄清了四种原虫的感染在不同海域和不同贝类品种上的差异，为中国四种原虫病的有效防治提供重要的科学依据。

近年来，中国贝类养殖和种苗繁育过程中，各种病害频繁爆发，造成了严重的经济损失，病原微生物感染是造成贝类死亡的主要原因(柳忠传等, 1996, 海洋信息, (03): 19; 戴光宇等, 2007, 温州农业科技, (3): 25-26 ; 张锡佳等, 2007, 齐鲁渔业, (11): 34-35)。种(亲)贝携带病原体是影响种苗质量和最终导致养殖过程中疫病传播及发病死亡的重要原因，应尽快开展无特定病原体(SPF)贝类原种场建设，繁育提供无携带特定病原体(SPF)的健康贝类种苗给广大养殖户养殖。因此，我们认为加强对养殖海域环境保护、减少污染，加强养殖贝类疾病特别是原虫病的监测、防止疾病传播与蔓延，调整贝类养殖结构、合理控制养殖规模和容量、提高贝类自身抗病能力，严格种苗检疫、提高种苗质量，有效控制贝类疾病通过种苗传播，已成为当前中国贝类养殖及其种苗繁育中最为紧迫的任务，这对保障中国贝类养殖业的健康可持续发展都具有重要意义。

3 材料与方法

3.1 病原体和样品采集

由于牡蛎是中国最主要的贝类产品，因此本研究针对牡蛎的四种原虫病，按不同海域和不同贝类品种来分析其检测结果，同时对采集的贝类苗的感染率进行分析。

 2006~2012年间，从辽宁、山东、浙江、福建、广东、海南和广西等海域，采集牡蛎(5 419)、文蛤(1 026)、扇贝(1 012)、菲律宾蛤仔(1 005)、贻贝(513)、血蛤(506)、溢蛏(503)、鲍鱼(521)、花甲螺(569)、沙包螺(107)和贵妃螺(110)等贝类样品。采集方法为每月定时从各个海域采集样品，加冰打包后空运到本研究室，到达后即时用剪刀采集鳃和消化腺组织共约1 g，使用碾磨磨碎。为避免交叉污染，严格按照每份贝类样品使用一把剪刀和一个碾磨，使用过的剪刀和碾磨经彻底清洗，高压消毒后才能重复使用。尼氏单孢子虫、派琴虫、折光折光马尔太虫和包拉米虫的阳性DNA等由本室保存。

3.2 DNA的提取

取经碾磨磨碎的贝类样品共约90 mg，根据海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的说明书，使用蛋白酶K和消化液消化贝类样品4小时以后提取组织DNA。海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒和DNA片断胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司。

3.3引物

派琴虫、折光马尔太虫和包拉米虫的检测使用OIE推荐的引物(http://www.oie.int/en/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online)，尼氏单孢子虫的检测引物参照参考文献(Stokes et al., 1995)。引物由TaKaRa公司合成。

3.4 PCR的扩增体系和条件

PCR反应体系为50 μL：2×PCR Mix 25 μL，25 pmol/L的上游引物和下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL，以ddH₂O补足50 μL。根据OIE和参考文献20的推荐条件，分别使用派琴虫、折光马尔太虫、包拉米虫和尼氏单孢子虫的引物进行PCR扩增，凝胶电泳后记录和分析结果。PCR Mix及pEASY-T1试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；

3.5 PCR产物的克隆测序

对3.4中不同地区不同贝类，首次检测为阳性的部分样品，取40 μL PCR产物进行电泳，切下目的片段纯化回收后与pEASY-T1于25℃连接10 min，转化Trans-T1感受态细胞。挑取阳性重组菌送大连宝生生物技术有限公司进行测序，分析并用Blast在线软件比对测序结果。

作者贡献

谢丽基在整个实验过程贯穿始终，是实验设计、实验操作内容以及论文整理方面的主要完成者；通讯作者谢芝勋提供整个实验的一切费用支出和理论指导；刘加波负责样品的收集和处理，庞耀珊和邓显文负责样品的抽提；谢志勤和范晴负责样品的PCR；罗思思负责凝胶电泳。

致谢

    衷心感谢大连海洋大学赵力强、中国水产科学研究院黄海水产研究所李彬、浙江省海洋水产养殖研究所闫茂仓、厦门大学王蕾、广东海洋大学蓝尉冰、海南省动物疫病预防控制中心方莉的帮助与支持。本项目由国家百千万人才工程人选专项(945200603)、广西特聘专家专项(2011B020)和广西科技攻关 (桂科攻0630001-3M)共同资助。

参考文献 

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